Co NTA Beads 6FF重力柱说明书

货号：YA2420

规格：1x1mL/1x5mL/5x1mL/3x1mL+1x5mL/5x5mL

保存：2°C - 8°C

产品介绍：

Co NTA Beads 6FF可以从原核和真核表达系统中一步纯化His 标签蛋白。该产品是以高度交联的6%琼脂糖凝胶为基质，配体以四配位键螯合钴。Co NTA Beads 6FF相比Ni NTA Beads 6FF对His标签蛋白具有更高的选择性。具体性能见表1。

表 1. Co NTA Beads 6FF的产品性能

Co NTA Beads 6FF可以耐受一定范围的变性剂和其他的添加剂，如表2。

表 2. Co NTA Beads 6FF试剂耐受情况

Note: 1、Co NTA Beads 6FF立即用平衡液平衡，否则介质会变色。不要将介质保存在含有β-Mercaptoethanol的缓冲液中。

2过高浓度的咪唑有可能会降低蛋白回收。

3乙醇有可能造成蛋白沉淀，降低蛋白回收率和堵柱子。

4 Tris 与金属离子微弱结合造成载量降低。

避免使用下列试剂：DTT (dithiothreitol), DTE (dithioerythritol) and TCEP (TRIS(2-carboxyethyl) phosphine)，会降低介质的蛋白载量。

EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 、EGTA (ethylene Glycolbis ([β-amino-ethylether])会将钴离子从介质上剥落。

2. 纯化流程

2.1 Buffer 的准备

推荐使用中性偏碱缓冲液（pH7-8）,如磷酸盐缓冲液。可加入0.3-0.5M 氯化钠减少非特异性吸附。在蛋白结合力弱的条件下避免使用Tris-HCl。应避免使用螯合剂EDTA 和柠檬酸盐缓冲液。

可溶性蛋白纯化

结合液: 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, pH 7.4

洗杂液: 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 5 mM imidazole, pH 7.4

洗脱液: 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 150 mM imidazole, pH 7.4

洗杂和洗脱液中的NaCl和咪唑浓度可根据需要增加或减少。

包涵体纯化

可在结合液、洗杂液和洗脱液中添加8M 尿素或6M 盐酸胍促进蛋白的溶解。

2.2 样品准备

2.2.1 细菌或酵母表达的蛋白

1. 挑取单菌落到LB培养基中，根据载体使用说明加入相应浓度的诱导剂诱导相应的时间。

2. 表达结束后，将培养液转移到离心杯中，7,000rpm，离心15min收集菌体，然后加入1/10 体积的Lysis Buffer和PMSF，PMSF 在破碎前加入，最终浓度为1mM。加入溶菌酶（工作浓度为0.2-0.4mg/ml，如果表达的宿主细胞内含pLysS 或pLysE，可以不加溶菌酶），（同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合）。

3. 将菌体沉淀悬浮起来，（如果菌液浓度高，也可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I），混匀，放置于冰上，然后冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

4. 将澄清的破碎液转移至离心管中，10,000rpm下，4度离心20-30 分钟。取上清，置于冰上备用或-20度保存。

2.2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1. 将细胞培养液转移至离心杯，5000rpm下，离心10min，收集菌体得上清，如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质，即可直接加入柱子使用；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，需用1×PBS 4℃下透析才能加入柱子。

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